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室间质评

高通量测序实验室各功能区的基本分区原则

发布时间:2019-09-25

高通量测序包括:实验室检测(样本处理及核酸提取、文库制备及富集、质检和测序)和生物信息学分析两大部分,任何样本源性污染、barcode源性污染、扩增产物污染或气溶胶污染均可导致假阴性或假阳性结果的出现。因此,各实验室应遵循分区一般原则:各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作,依据自己的检测平台数量、检测流程、检测项目的多少及工作量大小制定切实可行的分区及各区面积大小安排方案。具体的区域数和空间大小具个体化,以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”为基本准则。

     各区独立:即各实验室区域之间在物理上应永久性处于分隔状态。高通量测序实验室至少包括试剂准备区、标本与文库制备区、文库扩增与检测区和测序区,依据不同的检测平台和检测项目,具体分区情况不同。需要注意:不可使用连通各区的中央空调,不可采用家庭装修模式,不可使用造成门下留有缝隙的上吊推拉门或平开门。传递窗应设置双开,最好一侧门关好时,另一侧门不能打开。

     注意风向:因为每次扩增后均有大量由标本扩增而来的产物存在。检测过程中微量离心管子的打开与关闭,以及样本吸取过程中吹打动作均会造成样本或产物气溶胶的形成,极易对其他扩增反应造成污染。为防止扩增产物顺着空气气流进入上游扩增前的相对“洁净”区域,可在每个区域设置缓冲间(正压负压均可),隔绝实验室内外空气。若缓冲间安装正压进气装置,则缓冲间的气压相对高于工作区和外界环境气压,使实验室内空气不能流出,实验室外空气不能流入;若缓冲间安装负压排风装置,则实验室内或实验室外的空气在缓冲间即可被抽走。正压或负压缓冲间均可避免工作区域内空气和外界环境空气互通。现有很多基因扩增实验室在分区设计时除了缓冲间有正负压外,各区内也设置有正负压,如试剂准备区为一定的正压(+10Pa,标本制备区正压稍弱于试剂准备区(+5Pa),其后的各区依次负压,这是完全没有必要的,因为缓冲间的正负压设计已经起到了将各区域空气流动有效分隔阻断的作用而且由于区域较多,一直压力递增也不合适。各区域最重要的是通风换气,建议通风换气次数>10/小时,如果一天内使用同一区域多于两次,建议有更多的通风换气次数,有助于残留DNA“污染”的清除。

     因地制宜:高通量测序实验室的分区设计没有固定模板,不是千篇一的,必须依据具体情况具体分析。各区之间最重要的是物理分隔,既可以相互邻近,也可以分散在同楼层的不同处,甚至可以分散在不同的楼层。对于新建实验室应尽可能做到合理,易于管理。对于旧的实验室不必强求理想状态,可根据原有实验室的分布现状及空间大小进行合理安排,只要符合各区独立,注意风向,方便工作的原则即可。

     方便工作 :对高通量测序实验室进行严格的分区设计是为了在物理上防止污染的发生。但同时也应最大限度的考虑各区域分隔设计及空间和区域面积大小的合理性是否方便日常检测工作。除此之外,大型仪器设备的进出是否方便也是分区时应考虑的。
     
工作有序:保证实验室 检测获得可靠结果的重要前提条件之一。试想如果一个实验室的区域和检测流程的安排,因为多个检测平台的存在、检测流程的差异而处于一种混乱状况, 会大大增加出现差错的可能性。通常实验室不会只有 1个检测项目或检测panel,工作量的差异也可能较大,但作为高通量测序实验室,工作量过小,则起不到高通量检测的作用,工作量大,则意味着实验室仪器设备的数量增加,较大型自动化仪器设备配置,一天内各区域可能重复使用等,为保证工作有序,对区域面积大小,甚至区域数量,都会有额外的要求。

   互不干扰、防止污染和报告及时:高通量测序实验室由于检测项目和检测流程的不同而出现相互干扰的可能性必须要考虑,一旦工作出现相互干扰, 也就很难防止污染的发生,也不太可能及时发出检测报告。例如,一个高通量测序实验室同时开展NIPSANIPT、遗传病和肿瘤基因突变(组织和血浆ctDNA)检测,为了避免不同检测项目之间相互干扰,以及高浓度组织样本核酸提取及后续扩增和杂交捕获等过程中出现的气溶胶,对低浓度游离DNA样本核酸提取造成的交叉污染,还需要设置多个标本制备区及相应后续扩增等区域。又如,进行NIPS/NIPT的实验室,由于从血浆中提取的是母体血浆CfDNA.其中胎儿cffDNA相对微量,为防止组织提取高浓度DNA污染,造成胎儿cffDNA的百分比更低,现假阴性结果,因此涉及高浓度组织或细胞DNA提取项目的标本制备区不可与其共用。此外,遗传病和肿瘤把向药物治疗的高通量测序检测过程较NIPS/NIPT要复杂许多。需进行更加细致区域划分,至少应包括试剂准备区、标本与文库制备区、杂交捕获区、文库扩增区和测序区等。若组织样本在测序前需要进行包埋处理及HE染色判断样本质量肿瘤细胞含量及百分比),则应增设样本制备前区。若使用不同的杂交捕获方法对不同类型的样本进行捕获,为避免交叉污染,应设置多个杂交捕获区。在文库制备过程中,若需要进行不同目的核酸的多次扩增,则应将扩增区合理划分为扩增一区、扩增二区等。由于样本DNA提取、DNA片段化后质量鉴定及DNA纯化和回收等步骤均需要用到电泳,从节省仪器设备费用的角度,可以考虑单独设置一个电泳区放置Agilent生物分析仪和()凝胶电泳仪:不同检测项目、不同检测平台的电泳

可以在此区共同完成。区域的设置也与日常工作量及检测过程的自动化程度相关。此外,实验室设计还要考虑高通量测序检测结果的确认方法运行的空间和区域问题,遗传病的靶向测序外显子和全基因组测序一般都会涉及些测序区域出现的阳性序列结果的确认,确认方法一般采用Sanger测序,一代测序仪可与高通量测序仪放在一个区域 ,但Sanger测序前的扩增产物电泳及纯化可放在单独设置的电泳区内。除此之外,肿瘤基因突变的靶向测序、全外显子测序等也可能涉及确认实验,通常的确认方法为PCR基因芯片、数字PCRARMS、高分辨熔点曲线分析或另一经过验证的高通量测序方法等,需要考虑这些确认实验相应仪器设备和工作流程有造成工作干扰和交叉污染发生的可能,从而合理安排这些仪器设备的放置区域和工作流程。

    高通量测序实验室的每一区域都须有明确的标记,各区的仪器设备及工作服、鞋、实验记录本和笔等都必须专用,不得混淆。此外,每个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯和可移动紫外灯,以便于对工作后的区域进行照射,减少上一次标本检测遗留核酸及扩增产物的污染。